木耳分离方法有：①耳木分离法，将菌丝生长健壮的耳木，用接种针挑取气生菌丝于试管内，或将有菌丝的风干耳木用解剖刀挑取少量木屑置于试管。②耳基分离法，将性状好的子实体耳基进行组织分离，先用水冲洗，然后在0.1％升汞液内浸泡1分钟。切取米粒大小的组织块，供接种用。③剥片分离法：将子实体剥开，从内部取出菌肉接种，也应洗净灭菌后再用。④干耳片分离法，取晒干耳片，用20％酒精浸泡1分钟，用解剖刀切块后用于接种。