理论上，培养料所有部位温度都达到100℃后维持4～6小时，可以杀灭培养料中的各种杂菌。但在实际操作中，由于加温方法和炉灶结构的关系，锅的中心与边缘及死角的温度并不一致，一般生产者无法测出各部位培养料都达到100℃的确切时间，所以为保证杀灭培养料内的有害病菌，往往需延长灭菌保温时间。一般中心温度达到100℃后，维持8～12小时后即可以停火保温，待温度降至稍高于常温，可取出冷却。由于锅中的水和料袋的温度上升至100℃需要时间，灭菌后料袋温度冷却至手能拿出也需要时间，所以从开始加温到料袋取出一般实际需要24～32小时。另外由于锅的外形和大小、锅外壁的保温性能、锅中装袋间隙和袋中培养料的松紧度都各不相同，所以在大批量生产前一定要以成品率的高低为标准适当做调整，最终确定升温、100℃保温和维持降温总共所需的时间，有时甚至要超过32小时。